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什么是荧光定量PCR、数字PCR?

2022-11-23 金梦
一、技术篇


在全球医疗器械行业中,体外诊断是占比最高的细分领域之一,根据诊断原理的不同,体外诊断产品分为分子诊断、免疫诊断、生化诊断等多种类型。其中,分子诊断的灵敏度、特异性、准确性等均较为突出,尤其是在新冠肺炎疫情全球蔓延的大背景下,以PCR为代表的分子诊断技术得到了加速发展。

PCR,即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的英文缩写,是一种以DNA双链复制原理为基础,对特定核酸样本进行体外扩增的生物技术,能够将微量的核酸样本迅速拷贝至几百万倍,便于后续的分析研究。该技术源起于20世纪70、80年代,经过几十年的发展,经历了初代传统PCR、第二代荧光定量PCR和第三代数字PCR的演变,在医疗筛查诊断、生命科学基础研究、法医分析鉴定及食品卫生和环境检测等方面得到广泛应用。


1.荧光定量PCR          

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术,简称qPCR,是在PCR反应体系中加入荧光物质(荧光染料或荧光标记的特异性探针),利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

荧光定量PCR

与普通PCR相比,实时荧光定量PCR技术是一次由定性技术向定量技术的飞跃。运用该项技术,可以对DNA、RNA样品进行相对定量、定量和定性分析。

荧光定量PCR实验过程

(图:荧光定量PCR实验过程)



2.数字PCR         

数字PCR即Digital PCR(dPCR),它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR,数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。PCR实际上是一个在模板DNA、引物(模板片段两端的已知序列)和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促合成反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。

数字PCR技术原理

(图:数字PCR技术原理)


根据微反应单元的不同形式,数字PCR产品可分为微板式、微滴式和芯片式等。目前,市场上主要的数字PCR产品主要是基于微滴式和芯片式。


三代核酸检测技术对比:

技术方法

概念

技术优势

技术劣势

传统PCR

采用普通PCR扩增仪扩增靶基因,通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析

1.可实现特定核酸片段的体外复制

1.相关核酸染料对操作人员和环境具有危害

2.易出现假阳性结果

3.耗时时间长、操作复杂

4.无法准确定量

荧光定量PCR

是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。

1.污染风险低

2.操作流程更简单、经济高效

3.样品加样量少

1.不同厂家生产的试剂和设备之间的差异对检测结果影响较大,不具备可比性

2.存在背景值的影响,结果易产生偏差

3.低拷贝的DNA难以检测

4.受PCR抑制物的影响较大

数字PCR

将核酸样品分配到大量独立、平行的微反应单元(纳升级)中,部分反应单元包含靶标分子(阳性),而其他不包含(阴性),接着进行扩增,并利用TaqMan化学试剂或染料标记探针检测靶标序列,能够实现靶标分子的绝对计数。

1.特异性强、灵敏度高

2.绝对定量,准确性好

3.抗干扰能力强

1.特异性强、灵敏度高

2.绝对定量,准确性好

3.抗干扰能力强




一、光学原理解决方案篇



1.荧光定量PCR       

荧光定量PCR二向色镜荧光定量PCR


荧光定量PCR光路图荧光定量PCR光路图
(图:荧光定量PCR光路图)


荧光定量PCR光谱
(图:荧光定量PCR光谱)


解决方案一:

荧光通道激发波长发射波长二向色镜
技术参数
Atto425Ex 430/10Em 480/10\设计波段 300-1100nm@OD6
FAMEx 470/10Em 515/10\中心波长误差±2nm
HEXEx 535/10Em 565/10\半带宽10±2nm
ROXEx 585/10Em 614/10\实现方式单片 / 胶合
CY5Ex 630/10Em 670/10\镀膜工艺磁控溅射 / 真空镀膜
CY5.5Ex 682/10Em 725/10\峰值透过率>85%

  

解决方案二:

荧光通道激发波长发射波长二向色镜
技术参数
FAMEx 470/30Em 520/20505二向色镜设计波段 300-1100nm@OD6
HEXEx 530/20Em 565/20550二向色镜中心波长误差±3nm
ROXEx 570/20Em 615/20590二向色镜半带宽30±3nm、20±2nm
CY5Ex 630/20Em 675/20647二向色镜实现方式单片 / 胶合

镀膜工艺磁控溅射 / 真空镀膜
峰值透过率>90%


2.数字PCR        


数字PCR滤光片

数字PCR


数字PCR光路图

数字PCR光谱

(图:数字PCR光路图)(图:数字PCR光谱)


解决方案:

荧光通道激发波长发射波长二向色镜
技术参数
FAMEx 488/20Em 527/20505二向色镜设计波段 300-1100nm@OD6
HEXEx 527/20Em 567/15550二向色镜中心波长误差±2nm
ROXEx 572/28Em 615/24590二向色镜半带宽20±2nm
CY5Ex 625/26Em 661/11647二向色镜实现方式单片 / 胶合

镀膜工艺磁控溅射 / 真空镀膜
峰值透过率>90%


标签: PCR 荧光定量
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